isolasi DNA

 Isolasi DNA 

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya (Corkill dan Rapey, 2008)

Saat ini kita dapat menemukan berbagai macam metode ektraksi DNA. Para peneliti selalu berusaha menyederhanakan tahapan yang digunakan atau mengurangi jumlah perlakukan. Tahapan atau perlakuan yang terlalu panjang dan terlalu kompleks sering meningkatkan resiko kegagalan, terutama bagi pemula. Tahapan atau perlakuan dalam ekstraksi DNA juga dipengaruhi asal sel/jaringan target (Epplen dan Lubjuhn, 1998)

1.2. Tujuan

Untuk mengetahui proses pelaksanaan ekstraksi DNA.

2. TINJAUAN PUSTAKA

DNA biasanya diisolasi dari sel dengan menggunakan metode yang melisiskan sel tetapi mencegah fragmentasi DNA. Langkah ini biasanya melibatkan EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) yang dalam proses tersebut akan mengikat ion magnesium (kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim DNase). Idealnya dinding sel (jika ada) didigesti secara enzimatis (misalnya dengan enzim lisosim). Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika disrupsi fisik dibutuhkan sebaiknya dilakukan seminim mungkin. Dalam proses disrupsi ini enzim nuklease yang terlepas dari komponen selular dapat mencerna asam nukleat secara efisien, sehingga kerja enzim nuklease harus dihambat. Disrupsi sel dan sebagian besar langkah selanjutnya sebaiknya dilakukan pada suhu 4 0C, menggunakan alat yang terbuat dari gelas dan larutan yang telah di-autoclave (fungsi autoclave adalah untuk menghancurkan aktivitas DNase pada alat atau larutan tersebut). Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan dengan penambahan RNase yang telah diterapi panas untuk menginaktivasi DNase kontaminan (RNase relatif stabil terhadap panas karena adanya ikatan disulfida yang akan menyebabkan proses renaturasi ketika didinginkan). Kontaminan mayor lainnya, yaitu protein, dihilangkan dengan dengan larutan fenol atau campuran fenol-khloroform (keduanya akan mendenaturasi protein tetapi tidak mendenaturasi asam nukleat). Setelah campuran tersebut dibuat menjadi emulsi, dilakukan pemusingan. Setelah pemusingan akan terbentuk bagian organik di bagian bawah dan bagian aqueous di bagian atas dipisahkan lapisan yang terdiri dari protein yang terdenaturasi. Cairan aqueous diambil dan dideproteinisasi beberapa kali sampai tidak ada lagi material yang terlihat pada lapisan tengah. Kemudian DNA yang sudah tidak mengandung protein ini dicampur dengan dua bagian etanol. DNA akan menjadi presipitat, terpisah dari larutan sampel tersebut. Setelah dipusingkan, pelet DNA kemudian dilarutkan kembali (Epplen dan Lubjuhn, 1998).

Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai berikut (Corkill dan Rapey, 2008):

1)      homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 4 0C, semua bahan dan peralatan steril)

2)      lisis seluler (dengan detergen atau lisosim)

3)      penambahan chelating agents: EDTA/sitrat

4)      penambahan proteinase (proteinase K)

5)      ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)

6)      presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol)

7)      pelarutan kembali DNA, misalnya dengan bufer TE (Tris-EDTA)

Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam nukleat. Agen chaotropic seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate), NaI (sodium iodide), dan LiCl (lithium chloride) memiliki kemampuan untuk menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein dan menginaktivasi nuklease. GuSCN dengan molaritas di atas 4 M dapat mempresipitasi DNA dan RNA berberat molekular tinggi. Dalam lingkungan yang tinggi garam chaotropic ini senyawa silika dapat berikatan secara spesifik dengan molekul DNA dan RNA, sedangkan lemak dan protein kontaminan hanya mempunyai afinitas yang moderat terhadap silika sehingga dapat dicuci bersih darinya. Absorbsi asam nukleat pada matriks silika meningkat pada pH asam dan konsentrasi garam yang tinggi, sehingga larutan bufer yang mengandung pH yang tinggi dan konsentrasi garam yang rendah dapat digunakan untuk mencuci-lepaskan asam nukleat dari matriks silika. Cara lain pemanfaatan silika dalam proses ekstraksi asam nukleat adalah dengan melakukan perubahan kimia pada matriks silika sehingga akan secara spesifik berikatan dengan protein atau polisakarida (prosesnya berkebalikan dengan penjelasan sebelumnya). Ekstraksi asam nukleat berbasis silika ini telah menjadi dasar metode ekstraksi asam nukleat kit komersial. Matriks silika dalam kit komersial tersebut dapat ditemukan dalam berbagai bentuk, seperti filter (spin column), gel (glassmilksilica gel), suspensi (celiteplain-coarse silicate), bahkan partikel berselubung magnetik (Dynabeads). Filtrasi, sentrifugasi, atau penggunaan magnet memungkinkan pemisahan asam nukleat yang berikatan dengan silika dari kontaminasi lemak, karbohidrat dan protein melalui langkah pembilasan yang multipel. Metode ini juga mendasari pembuatan alat ekstraksi asam nukleat. Metode alternatif yang berbasis matriks silika antara lain teknik hibridisasi fragmen asam nukleat yang menggunakan probe yang didesain spesifik yang melekat pada matriks solid atau bead magnetik. Kelemahan umum dari teknik penangkapan seperti ini adalah selama proses pelekatan dan cuci-lepas, dapat terjadi fragmentasi dan hilangnya DNA target.

DNA juga dapat diisolasi dari organela spesifik atau partikel virus. Untuk ekstraksi DNA semacam ini sebaiknya dilakukan isolasi organela target atau virus tersebut terlebih dahulu sebelum dilakukan ekstraksi DNA-nya karena isolasi DNA target dari campuran DNA (DNA total) relatif sulit. Jika dibutuhkan isolat DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNA dapat dimurnikan dengan density gradient centrifugation menggunakan CsCl (Caesium chloride) (Corkill dan Rapey, 2008).

g per-ml per-cm pada panjang gelombang 260 nm. Rasio absorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein atau fenol (protein memiliki absorbsi maksimum pada 280 nm). Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. Saat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik yang secara otomatis mengkalkulasi rasio 260/280 nm dan kuantitas asam nukleat. Yang perlu diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan “blank” sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel. Yang digunakan sebagai “blank” adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa (Harisha, 2007)mUntuk memeriksa integritas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose. Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer UV. DNA untai tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027, DNA untai ganda 0,02 dan RNA 0,025

3. METODE

3.1 Metode Pembuatan Larutan buffer:

1 . Genomic Wash buffer1 (GWB 1) = 1 mL PureLink TM genomic wash buffer 1 + 1,5 mL `

1 ethanol abs. pa.

2. Genomic Wash buffer 2 (GWB 2) = 0,857mL PureLink TM genomic wash buffer 2 + 2mL

ethanol abs. pa.

3. Buffer AW1 = 1,9 mL Buffer AW1 + 2,5 mL ethanol abs. pa.

4. Buffer AW2 = 1,3 Buffer AW2 + 3 mL ethanol abs. pa.

3.2  Metode Isolasi DNA dari Darah (Fresh or Frozen Blood) PureLink Genomic DNA Kits

1. 200 µL darah dimasukkan pada microcentrifuge tube (ependorf) 1,5 mL

2. Ditambahkan 20 µL proteinase K

3. Ditambahkan 20 µL  RNase A,di vortek untuk menghomogenkan (tidak boleh lebih 5detik), dan di inkubasi pada RT selama 2 menit

4. Ditambahkan 200 µL PureLinkTM Genomiclysis/binding buffer,di vortek untuk menghomogenkan

5. Diinkubasi pada suhu 55°C selama 10 menit

6. Dltambah 200 µL ethanol absolute (96-100%) untuk melisiskan dan di vortek untuk menghomogenkan 5 detik

7. Dipindahkan pada PureLinkTM spin kolom yang ditaruh diatas collecting tube

8. Disentrifuse 12500 rpm selama 1 menit pada RT

9. DlpindahkanPureLinkTM spinkolom pada collection tube yang bersih lainnya.

10. Ditambah 500 µL PureLinkTM genomic Wash buffer 1 (GWB 1) yang telah dilarutkan pada etanol absolut

11. Disentrifuse 12500 rpm selama 1 menit RT

12. Dipindahkan PureLinkTM spinkolom pada collection tube yang bersih lainnya

13. Ditambah 500 µL PureLinkTM genomic Wash buffer 2 (GWB 2) yang Telah dilarutkan pada etanol absolut

14. Disentrifuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 3 menit RT

15. Dipindahkan PureLink TM spin kolom pada microcentrifuge tube (ependof) 1,5 mL yang steril

16. Ditambah 100 µL PureLink TM genomic elution buffer l

17. Diinkubasipada RT selama 1 menit

18. Disentrufuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 1 menit pada RT

19. Disentrufuse pada kecepatan max 15000 rpm selama 1,5 menit pada RT

3.4  Isolasi DNA Dari Bercak Darah Kering (Dry Blood Spots) QiAamp DNA Micro Kit

1. Siapkan 3 potong bercak darah kering dengan diameter 3 mm dan maeukkan pada 4 tube Mikrosentrifuse

2. Ditambahkan 180 µL Buffer ATL

3. Ditambahkan 20 µL proteinase K dan di vortek untuk menghomogenkan (tidak boleh lebih 5 detik)

4. Diinkubasi pada suhu 56°C dengan dishaker 900 rpm selama 1 jam (Seandainya tidakada alatnya, bisa menggunakan heater 56°C dan divortex selama 10 detik setiap 10menitnya)

5. Disentrifuse sebentar supaya turun kebawah kira-kira 2500 rpm selama 10 detik

6. Ditambah 200 uL buffer AL dan di vortek untuk selama 10 detik.

7. Diinkubasi pada suhu 70°C dengan dishaker 900 rpm selama 10 menit (Seandainya tidak ada alatnya, bisa menggunakan heater 70°C dan divortex selama 10 detik setiap 3 menitnya)

8. Disentrifuse sebentar supaya turun kebawah kira-kira 2500 rpm selama 10 detik

9. Dipindahkan dengan hati-hati “lysate” (cairan yang mengandung darah dari bercak darah kering yang terlisiskan) ke dalam kolom QIAamp MinElute (QM) tanpa membasahi bibir dan disentrifuse 8000 rpm selama 1 menit pada RT. Dipindahkan kolom QM pada collection tube yang bersih lainnya.

10. Ditambahkan 500 µL Buffer AW1 tanpa membasahi bibir. Dan disentrifuse 8000 rpm selama 1 menit pada RT. Diplndahkan kolom QM pada collection tube yang bersih lainnya. .

11.Ditambahkan 500 uL Buffer AW2 tanpa membasahi bibir. Dan disentrifuse 8000 rpm selama 1 menit pada RT. Dipindahkan kolom QM pada collection tube yang bersihlainnya.

12. Disentrifuse pada kecepatan max (14000 rpm) selama 3 menit pada RT untuk mengeringkan membrane dengan sempurna

13. Dipindahkan kolom QM pada microcentrifuge tube (ependof) 1,5mL yang bersih. Ditambahkan 100 µL buffer AE.

14. Diinkubasi pada RT selama 1 menit. Disentrifuse kecepatan max (14000 rpm) selama 1 menit.

Pembuatan larutan buffer:

4. KESIMPULAN

Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa Isolasi DNA dapat dilakukan baik dari darah segar/ beku (apabila sampel lebih dari 200µL) menggunakan PureLink Genomic DNA Kits dan Bercak Darah Kering (Dry Blood Spots, jumlah sampel hanya 10µL) dengan QiAamp DNA Micro Kit.

DAFTAR PUSTAKA

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.

Epplen, J.E., dan T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin.

Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology).Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s